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　　申请代码 受理部门 收件日期 受理编号 检查保护 国家自然科学基金 申 请 书 (2010 版 ) 资助类别： 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 亚类说明： 1)如果您是 Word2000,word XP, word 2003 或以上版本用户，请把 Word 附注说明： 宏的安全性设为:中 方法: Word 菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 项目名称 ： (如果您是 Word97 用户，继续执行以下步骤) 申 请 人： 电话： (如果您是 Office2007 用户，点击 word 左上角安全警告处选项 依托单位 ： 中的启用此内容) 通讯地址 ： 2)关闭本文档，重新打开本文档 邮政编码： 单位电线)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了 电子邮箱： 申报日期： 2010年3月10 日 国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书 2010 版 基本信息 [在此录入修 出生 姓 名 改] 性别 年月 年 月 民 族 申 学 位 职称 每年工作时间 （月） 请 电 话 电子邮箱 人 传 真 国别或地区 中国 信 个 人 通 讯 地 址 息 工 作 单 位 主 要 研 究 领 域 依 名 称 [在此录入修改] 托 单 位 联 系 人 电子邮箱 信 息 电 话 网站地址 合 单 位 名 称 作 研 究 [在此录入修改] 单 位 信 [在此录入修改] 息 [在此录入修改] 项目名称 项 资助类别 亚 类 说 明 目 附注说明 基 申请代码 本 信 基地类别 息 研究年限 年 月 — 年 月 研究属性 (限 400 字)：微重力环境下 T 细胞活化抑制是航天员免疫功能下降的重要原因，而 T 细胞的 氧化还原状态和 actin 骨架功能又是其活化的关键因素。项目组前期证实 Trx 既可以调节细 摘 胞的氧化状态又可以调节 actin 骨架的重塑功能，因此提出如下假说：Trx 可能在微重力环 境下对 T 细胞活化有重要的调节作用。本研究拟通过回转模拟微重力，以 CD3/CD28 共刺激 活化 Jurkat T 细胞建立研究模型。然后通过免疫突触形成、CD69 细胞阳性率、细胞因子 IL-2 分泌量来评价该模型。进而通过真核载体过表达 Trx 或通过 RNAi 技术下调 Trx，以细胞氧化 应激水平为切入点，重点分析细胞活性氧水平，总抗氧化能力，蛋白质氧化损伤状态；以actin 要 骨架功能为切入点，重点分析骨架的形态，解聚聚合水平，氧化还原状态，从而深入研究 Trx 在微重力环境下对 T 细胞活化的影响。该项目将探索 Trx 新的细胞学功能，并且为防治航天 免疫功能下降奠定有益的理论基础。 关 键 词(用分号分开，最多 5 个) 微重力；Trx；antin 骨架；氧化还原状态；T 细胞活化 第 2 页 版本 1.000.000 国家自然科学基金申请书 2010 版 项目组主要参与者 （注: 项目组主要参与者不包括项目申请人，国家杰出青年科学基金项目不填写此栏。） 每年工 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 作时间 （月） [在此录入修改] 1 [在此录入修改] 2 [在此录入修改] 3 [在此录入修改] 4 [在此录入修改] 5 [在此录入修改] 6 [在此录入修改] 7 [在此录入修改] 8 [在此录入修改] 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 7 1 2 2 2 说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报 （含申请人），总人数由各分项自动加和产生。 第 3 页 版本 1.000.000 国家自然科学基金申请书 2010 版 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注 （计算依据与说明） 一.研究经费 20.0000 1.科研业务费 4.5000 （1）测试/计算/分析费 1.2000 Confocal,FACS 等检测费用 （2）能源/动力费 0.8000 水电费用 （3）会议费/差旅费 1.0000 调研，参加国内外各种会议 （4）出版物/文献/信息传播费 1.2000 检索信息，发表文章版面费 （5）其他 0.3000 办公用品，不可预计费用 2.实验材料费 15.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 11.3000 细胞分子生化试剂，细胞株，血清等 （2）其他 3.7000 细胞培养耗材等 3.仪器设备费 0.5000 （1）购置 0.5000 移液器，电泳仪，电转仪易损配件 （2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 公用大型实验设备的使用 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 0.0000 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 2.5000 研究生补助，临时工工资 四.管理费 1.0000 单位管理费用，约按 5%计算 合 计 23.5000 国家其他计划资助经费 与本项目相关的 其他经费资助 （含部门匹配） 其他经费来源 其他经费来源合计 0.0000 第 4 页 版本 1.000.000 国家自然科学基金申请书 2010 版 查看报告正文撰写提纲 报告正文 一、 立项依据与研究内容 1. 项目的立项依据 （1）项目的研究意义 苍茫太空，浩瀚无垠。随着 “神七”问天成功，长期深空探索对航天员医学保障 提出了更高的要求。而在空间飞行过程中,免疫调节机制的改变则对航天员的免疫细 胞功能、抗感染能力具有深远影响。空间特因环境包括微重力、噪声、振动、辐射、 昼夜节律改变、狭小生活空间、有害气体等，其中微重力持续时间最长，因而影响 也最为广泛。研究表明空间飞行以及模拟飞行过程中的微重力环境显著改变了由T 淋巴细胞介导的免疫应答：如T细胞增殖、细胞因子生成和T细胞亚群分布 （Baqai， 2009 ；Gridly，2009 ）。然而，我国在此方面的研究相对薄弱，多停留在现象描述阶 段，没有深入到分子-细胞-整体层面探究航天免疫功能下降的根本原因。 T细胞的氧化还原状态与细胞actin骨架重排都是其活化发挥功能不可或缺的 (Martin, 2008;Janis, 2008) 。项目组前期研究发现硫氧还蛋白 （Trx ）可以调节细胞的 氧化还原状态并且通过Cys残基影响actin骨架的结构功能。因此，我们提出如下假说： 在微重力所致氧化应激条件环境下，Trx可以通过调控T细胞的氧化还原状态和actin 骨架的结构功能而调节其活化的过程。从而在细胞和分子水平解释航天微重力环境 下T淋巴免疫功能受到抑制的原因，为对抗措施的制定提供有益的理论参考。 2. 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题 （1）项目研究内容 本项目拟采用 Jurkat T 细胞为研究对象，研究微重力环境下 Trx 对 T 细胞活化 的影响。重点研究 Trx 通过调节细胞的氧化应激水平及 actin 骨架的氧化还原状态， 调节 T 细胞活化的过程。主要内容包括： 一．微重力条件下 T 细胞活化的细胞模型研究 1．微重力条件下 T 细胞活化的细胞模型建立：通过回转器 （NASA ）模拟微 重力，通过 CD3/CD28 双信号刺激 Jurkat T 细胞使之活化以建立细胞模型。 2 ．微重力条件下 T 细胞活化的细胞模型评价：以细胞 actin 骨架的极化为活化 早期标志，以 CD69 阳性细胞率为活化中期标志，以 IL-2 、IFN-γ 分泌量为活化晚 第 5 页 国家自然科学基金申请书 2010 版 期标志指标评价该模型的有效性。 T 细胞氧化应激程度的量化分析：以细胞总抗氧化能力、活性氧水平和蛋白质 氧化修饰 （硝基化）为指标评估微重力导致 T 细胞发生氧化应激的程度和水平。 二．微重力条件下 Trx 对 T 细胞活化的影响 1．Trx 在 T 细胞活化过程中的变化：分析 CD3/CD28 激活前后的 T 细胞中 Trx 基因的 mRNA 水平、蛋白质水平及其酶活性确定 Trx 在 T 细胞活化过程中的变化。 2 ．Trx 对 T 细胞活化过程中氧化还原状态的影响：通过载体转染和 RNAi 技术 分别上调和下调 Trx，以细胞总抗氧化能力、活性氧水平和蛋白质氧化修饰 （硝基 化）为指标评估 T 细胞的氧化还原状态。 （2 ）项目研究目标 通过研究 T 细胞的氧化应激水平和 actin 骨架功能变化，确定 Trx 对微重力下 T 细胞活化过程的影响，为进一步用于航天免疫功能下降的防护提供理论参考。 1.阐明微重力对 T 细胞活化过程的影响。 2.揭示 Trx 对 actin 的氧化还原调节在T 细胞活化过程的作用。 3.发表研究论文 4-5 篇，其中 SCI 收录 1-2 篇。 4.培养研究生 2-3 名。 （3） 拟解决的关键科学问题 1. 微重力条件下用于 T 细胞免疫功能研究的细胞模型建立； 2. 微重力导致 T 细胞发生氧化应激的量化标准建立； 3.微重力条件下 Trx 对 T 细胞活化的调节作用。 下列实验方案主要为解决这三个科学问题而设计。 3. 拟采取的研究方案及可行性分析 （1）（1）拟采取的研究方案 1．微重力下 T 细胞活化的模型建立：使用 NASA 产回转器模拟微重力环境， 采用 CD3/CD28 抗体协同刺激 Jurkat T 细胞，使之激活。 备选方案：也可采用细胞因子受体激活剂 SDF- 1α 激活 Jurkat T 细胞。 2 ．微重力下 T 细胞活化的细胞模型评价：通过免疫细胞化学染色法确定 T 细 胞 actin 骨架的形态分布；利用流式细胞仪检测 CD69 阳性细胞率；采用 ELISA 方法 测定 IL-2 、IFN-γ 分泌量。 备选方案：也可采用 phalloidin 标记 actin 骨架的形态；采用放射免疫法检测 IL-2 、IFN-γ 的分泌量。 第 6 页 国家自然科学基金申请书 2010 版 3 ．T 细胞氧化应激程度的量化分析：采用铁离子还原法测定细胞抗氧化能力； DCFH 探针法测定活性氧水平；ELISA 硝基酪氨酸抗体法检测蛋白质氧化损伤 （硝 基化）程度。 备选方案：也可采用硝基四氮唑蓝还原 （NBT ）法测定活性氧水平；采用 ORAC 抗氧化能力指数 （oxygen radical absorbance capality）测定 T 细胞的抗氧化能力。 4 ．T 细胞 actin 骨架功能分析：采用免疫细胞化学染色法观察 actin 的形态变化； 采用超速离心法确定 F/G-actin 比率，确定 actin 的解聚聚合状态；利用 AMS 修饰法 分析 actin 蛋白 Cys 残基的氧化还原状态。 备选方案：也可采用 phalloidin 标记 actin 骨架的形态；采用荧光图像分析法确 定 actin 骨架的解聚聚合状态；采用质谱分析 actin 蛋白 Cys 残基状态。 5 ．Trx 在微重力条件下的变化：通过 Real-time PCR 方法测定 Trx 基因在 mRNA 水平的变化；通过 Western Blot 法检测 Trx 蛋白质水平的变化；采用 AMS 修饰法分 析 Trx 蛋白的还原能力。 主要研究方法： 1．免疫沉淀与 Western Blot 分析 依据 Weber 等[Qing Y et al., J Biol Chem, 2005; 280(3):1849-1853; Weber et al., Oncogene 2003; 22:4757–4759] 的方法测定Trx 与 actin 的相互作用。收集培养的约 70%密度的细胞， 于冰上加适量的细胞裂解液 （20mM Tris，pH 8.0 ，含 1% Nonidet P-40 ，NaCl (150 mM) ， NaF (50 mM) ，Na VO (1 mM)，leupeptin (10 g/ml)，aprotinin (10 g/ml)，pepstatin (1 g/ml) 3 4 和 PMSF (1 mM) 裂解。30min 后，15,000g 离心 30min 去细胞碎片。蛋白溶解产物与 Anti-Trx 抗体冰浴并搅拌 4h ，然后于溶解液中加 Protein A+G 并 4 ℃搅拌过夜。离心收集 免疫复合物，并用细胞裂解液洗 5 次，然后在 SDS样品缓冲液中沸煮 5min 。 SDS电泳并转移到PVDF 膜。5%脱脂奶粉室温封闭 1h，与抗 Trx 抗体 4 ℃孵育过 夜。经几次洗膜，加适宜浓度的抗鼠 HRP-IgG，加增强型化学发光底物显示免疫活性带。 2 ．细胞内活性氧(ROS) 的测定 测定方法参考(Bass)等的实验方案。2, 7-二氯氢化荧光素二脂(2’, 7’-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)本身没有荧光，可以顺利进入细胞，经细胞内脂酶作用生成同样不 发荧光的 2, 7-二氯氢化荧光素(2’, 7’-dichlorofluorescin, DCFH) 。2, 7-二氯氢化荧光素经 ROS 氧化而生成发荧光的 2, 7-二氯荧光素(2’, 7’-dichlorofluorescein, DCF) 。利用荧光酶 标仪可检测细胞内活性氧水平的变化。细胞接种在 96 孔荧光酶标培养板中，经过不同 第 7 页 国家自然科学基金申请书 2010 版 实验条件处理后用 PBS 缓冲液清洗三次，再加入 10μM DCFH-DA （溶于 DMSO ），在 5 ％ CO2，37℃，湿度 95 ％的二氧化碳培养箱中孵育 30 min， PBS 缓冲液清洗三次后在激 发波长 488nm，发射波长 533nm 的条件下用荧光酶标仪检测荧光强度的变化。 3 ． 细胞总抗氧化能力(T-AOC) 的测定 测定方法参考等(Benzie)的实验方案。主要原理为 Fe3+还原之后溶液颜色发生变化，可 通过荧光酶标仪进行比色分析。实验步骤如下： (1)醋酸盐缓冲液、TPTZ 溶液、FeCl3 溶液以 10：1：1(v/v)混合(现用现配) ，为 FRAP 工作液，预温至 37°C； (2)在 96 孔板中，加入 10μl 不同浓度的 FeSO4 标准液(0.125，0.25，0.375，0.5，0.75， 1mmol/l)和 10μl 待测样品，各三个重复； (3)每孔加入 30μl 双蒸水，混匀； (4)每孔加入 300μl FRAP 工作液，37°C 准确反应 4min ； (5)读取 OD593nm 值，作标准曲线，结果以 μg/mg protein 表示； (6)统计数据，得出曲线 ．F-actin/G-actin 比率分析 细胞内 F-actin 在裂解时不稳定并且对温度变化十分敏感，因此裂解过程中应保持适合的 温度条件，并使用条件较为温和的裂解液以保证 F-actin 的稳定性。实验步骤概括如下： (1)用 PBS 快速清洗细胞 2 次，加入预热的 LAS2 裂解细胞； (2)用细胞刮刀刮下后移至 EP 管中，然后用 200 μl 的枪头混匀细胞裂解液； (3) 以3500 rpm 离心 5 min 去除未裂解细胞； (4)将上清吸入标记好的超速离心管中，配平后对称放入已预热的超速离心机中； (5)37℃恒温下以 100000 g 离心 60 min； (6)将上清液吸入新的 EP 管中，并在超速离心管中加入与上清液等量的灭菌去离子水； (7)将 cytochalasin D 加入超速离心管中，用 200 μl 的枪头混匀后置于冰浴中 1 h； (8)取等量的沉淀液加入 LAS2 继续裂解； (9)取上清液 （G-actin ）和沉淀液 （F-actin ）Western Blot 检测。 可行性分析 1. 所涉及的氧化还原水平测定评价、蛋白质工程、基因工程、骨架形态、信号传导途 径等细胞生物学、分子生物学技术成熟，且每个技术环节均有备选方案，因此具有较 强的技术可行性。 第 8 页 国家自然科学基金申请书 2010 版 2.本课题组成员长期从事自由基生物学、分子生物学、免疫学等工作，具有较扎实的工 作与技术基础。参加人承担过多项国家科研项目，学术思想活跃，思路开阔，具有承 担、组织、实施该类科研课题的能力，能够确保在预定的周期内完成科研任务。 4. 本项目的特色与创新之处 申请者在前期研究基础上，结合空间氧化应激与免疫学研究的最新进展，提出 Trx 可 能在微重力条件下调节 T 细胞的氧化应激水平和 actin 骨架的氧化还原状态，而参与 T 细胞活化过程的调节，具有较强的理论创新性。同时，科研为空间飞行免疫功能下降 的防护与对抗提供有益的理论参考。 （1）建立微重力条件下 T 细胞活化的细胞模型：通过回转和双信号刺激建立模型，并 利用细胞 actin 骨架，表面活化标志物，细胞因子表达来评估该模型的有效性。 （2 ）确定氧化还原调节酶 Trx 对 T 细胞活化的影响：探讨 T 细胞氧化还原状态和 actin 骨架功能，把细胞结构和细胞状态结合起来；提出 Trx 通过与含有 Cys 活性位点 的actin 相偶联，实现对细胞骨架的调节作用，进而影响 T 细胞的活化过程。 5. 年度研究计划及预期研究结果 2011.01～2011.05 构建各类载体，为后续实验奠定物质与方法基础。 2011.06～2012.04 建立微重力条件下 T 细胞活化的实验模型，通过相关指标检 测，确定该模型的有效性。 2012.05～2012.12 完成 Trx 差异表达实验，并分析 Trx 的功能和活性 2013.01～2013.10 探讨 Trx 在微重力条件下对 T 细胞活化的调节作用。 2013.10～2013.12 完成课题总结与归档工作。 预期研究成果 1． 微重力条件下 T 细胞发生氧化应激和 actin 骨架功能紊乱而影响其活化过程。 2 ．Trx 通过调节细胞氧化应激水平和 actin 骨架功能而影响 T 细胞活化过程。 3 ．发表 SCI 论文 1-2 篇，培养研究生 2-3 名。 二、研究基础与工作条件 1. 工作基础 本项目是国家自然基金项目 《微重力下细胞氧化还原状态对 Actin 骨架调节作用研 究》（项目编号；20 ）的延续与发展。在该项目研究中，首次证 实了Trx 与 actin 的相互作用，鉴定了 Trx 第 62 位半胱氨酸是两者相互结合的关键位点， 揭示了 actin 骨架的氧化应激调节方式，发现了该调控方式的重要生物学意义。以上研 第 9 页 国家自然科学基金申请书 2010 版 究结果已经被 《Antioxidants Redox Signaling 》接收 （影响因子 6.19 ）。 前期关于 Trx 对细胞氧化还原状态及 actin 骨架调节的结果有： 图 1 Trx 与对 SH-SY5Y 细胞总抗氧化能力的调节作用 图 2 Trx 可以直接与 actin 相互结合 图 3 Trx保护了actin蛋白的半胱氨酸免受氧化 第 10 页 国家自然科学基金申请书 2010 版 图 4 Trx抑制了氧化应激引起的actin骨架解聚 图 5 Trx在氧化应激条件下对细胞存活率的影响 图 6 Trx在氧化应激条件下对细胞凋亡的影响 第 11 页 国家自然科学基金申请书 2010 版 2. 工作条件 项目组所在航天医学基础与应用国家重点实验室承担了国家重点型号任务， “973”、“863”、国家自然科学基金和军队重点试验技术研究等多项研究课题。实验室现 有设备基本能满足本项目需要。与本项目有关的仪器有：细胞离心机、双相多样本回转 器、倒置显微镜(Nikon)、荧光显微镜(Leica)、倒置荧光显微镜(Nikon)，显微图象分析与 动态记录系统、超低温冰箱(-70℃) 、低温冰箱、标准超净工作台、CO 恒温培养箱、连 2 续波长酶标仪(μQuant 美国 Bio-tek) 、FL800 荧光酶标仪(美国 Bio-tek) 、高速冷冻离心机、 超速离心机、各种台式低温离心机、高速组织匀浆仪、分析天平、电子天平(1/10 万) 、 标准无菌室两间、紫外可见分光光度计(Pharmacia)、真空干燥仪、真空浓缩仪(Heto)、 凝胶电泳成像系统(Pharmacia)、液氮罐、冷冻干燥机、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、 PE9700 型和 MJ-200 型基因扩增仪、实时荧光定量 PCR 仪、二维电泳系统、高压电泳仪、 Milli-Q 纯水器、表面等离子体生物传感器 SPR(TI) 、液闪计数仪、计数仪等。 图8 细胞离心机 双相多样本回转器 3. 申请人简介 xxx 主要研究领域是分子免疫学，研究方向为感染与先天性免疫的关系。十几年来分别 参加和主持了国家自然科学基金项目 “蚕的热休克应答”、“果蔬中痕量农药超灵敏免疫 分析的方法研究” （项目批准号）“黄酮类化合物对微重力条件下神经细胞影 响的机制研究”（项目批准号）课题的研究，参加和承担了十几项课题的研究 工作。主要研究领域包括分子免疫学、自由基生物医学、生物化学、细胞分子生物学等， 发表相关论文 50 余篇，其中 SCI 收录 13 篇，出版专著 1 部，并获军队科技进步二等奖 3 项，三等奖 3 项，获国防发明专利一项，2004 和 2008 年被评为全军优秀硕士研究生 论文指导教师。将在本项目中将负责理论指导和免疫功能分析工作。 1. Yang TB, Stark P, Janik K, Wigzell H, Rottenberg ME. SOCS- 1 protects against Chlamydia pneumoniae-inducedlethal inflammation but hampers effective bacterial clearance. J Immunol 2008; 180(6):4040-4049. 第 12 页 国家自然科学基金申请书 2010 版 2. He PL, Zhang LY and Yang TB. Determination of Ractopamine in Swine Feed and Urine Using an Indirect Competitive Immunoassay. J Anim Vet Adv 2008; 7 (3): 274-281. 3. Guo SH, Yan JQ, Yang TB, Yang XQ, Bezard E, and Zhao BL. Protective Effects of Green Tea Polyphenols in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson’s Disease Through Inhibition of ROS-NO Pathway. Biol Psychiatry 2007; 62(12):1353-62. 4. Trumstedt C, Eriksson E, Lundberg AM, Yang TB, Yan ZQ, Yeh WC, Wigzell H and Rottenberg ME. Role of IRAK4 and IRF3 in the control of intracellular infection with Chlamydia pneumoniae J Leukocyte Bio 2007; 81: 1-8. 5. Zeng K, Yang TB, Zhong P, Qu LN, Zhou SY, He J, Jiang ZS. Development of an indirect competitive immunoassay for parathion in vegetable samples Food Chem 2007; 102(4):1076- 1082. 6. Yang TB, Zhong P, Qu LN, Wang CY, Yuan YH. Preparation and Identification of Anti-2, 4-dinitrophenyl Monoclonal Antibodies J Immunol Method 2006; 313(1-2):20-28. 7. Fu K, Zhao YY, Tang WX, Zhong Y, Yang TB, Wang JH. Preparation and identification of monoclonal antibodies against daintain Hybridoma (Larchmt). 2006; 25(2):95-97. 8. Yang TB, Wang JH, Qu LN, Zhong P, Yuan YH. Preparation and identification of anti-melatonin monoclonal antibodies J Pineal Res 2006; 40(4):350-354. 9. Qu LN, Yang TB, Yuan YH, Zhong P, Li YH. Protein nitration is increased by simulated weightlessness and decreased by melatonin and quercetin in PC12 cells Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2006; 15(1):58-63. 10. Zeng K, Yang TB, Zhong P, Qu LN, Zhou SY, He J, Jiang ZS. Development and identification of monoclonal antibodies against parathion Hybridoma (Larchmt), 2005; 24(6):298-304. 11. Wang JH, Dun XP, Qu LN, Zhao YY, Yang TB, Chen ZW. Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies against pea albumin 1b (PA1b) Hybrid Hybridomics, 2005; 24(4):